諾如病毒ELISA檢測方法步驟

一、標本的采集和儲存

出現癥狀后72小時內采樣。
糞便量盡量不少于5ml。
貯存于2～8℃，但zui多不能超過3天；長期貯存應在－20℃或－70℃。
成形便和肛拭子診斷意義較小。

二、所需材料

　IDEIA™ norovirus試劑盒（DakoCytomation公司）
     1000µl和200µl微量加樣槍及相應不帶濾芯的槍頭
     酶標儀
     洗板機
     吸水性能好的衛生紙
     去離子水（無須高壓）或蒸餾水
     渦漩震蕩器
     離心機
     50ml管、1.5ml EP管及相應的架子

三、檢測前準備

將試劑和待檢測標本置于室溫（15～30℃）30min。
     陰性對照：將1ml樣品稀釋液（sample diluent）加至標記好的小瓶中作為陰性對照。
     陽性對照：1ml陽性對照液（positive control）溶解一瓶陽性對照， 顛倒混勻。未用完的陽性對照可在2～8℃貯存1個月，長期貯存應分裝存于-20℃。
     每次檢測均至少一個陽性對照和一個陰性對照。
     空白對照：空氣
     洗液的配制：1倍體積的洗液濃縮液（WASH BUFFER×25）加24倍體積的去離子水，當天用當天配。

四、標本準備

加入1ml樣品稀釋液至1.5ml 小離心管中，然后，加入0.1g固體糞便標本或0.1ml液體糞便標本，置于漩渦震蕩器充分混勻，室溫靜置10min，室溫下≥5000rpm離心5min，取上清進行檢測或置-20℃冰箱保存備用。

五、檢測步驟

1、將需要數量的微孔板置于微孔板架上。

2、每孔加入100µl 10％便懸液以及陰性對照，陽性對照。

3、每孔加入2滴（或100µl）酶結合物（conjugate），用槍頭輕柔混勻（上下5次左右），20～30℃靜置60±5min。

4、每孔加入350µl洗液（用手輕微搖動1 min左右），棄去洗液，在衛生紙上拍干，共洗5次。

5、每孔加入2滴（或100µl）底物液（Substrate），20～30℃靜置30min。待藍色顯現后迅速觀察顏色。

6、每孔加入2滴（或100µl）終止液（Stop solution），充分混勻。

7、讀取OD450值，打印輸出或記錄值。結果必須在加入終止液后30min內讀取。

六、結果判定

陰性對照：肉眼觀察無色或OD450值<0.15。

陽性對照：肉眼觀察呈現*的藍色或OD450值>0.50。

臨界值（cut-off value）：OD450值＝陰性對照OD450值＋0.10。

標本：

a）肉眼觀察藍色比陰性對照顏色深判定為陽性，肉眼觀察無色判定為陰性。

b）OD450值大于臨界值判定為陽性，小于臨界值判定為陰性，OD450值在臨界值±0.01

范圍內判定為可疑，應重復檢測或重新取樣。判斷陰陽結果按上述方法進行。若OD450值在臨界值仍在±0.01范圍內，仍判定為可疑，對于可疑樣品應用PCR方法來判定zui終結果。

七、注意事項

1、便標本處理時震蕩時應充分震蕩，特別是成形便或稀便，以便于病毒從標本中釋放出來。

2、加酶結合物（conjugate）后應用槍頭輕柔混勻（上下5次左右），以便于抗原抗體充分結合。

3、讀取吸光度應在加完終止液之后30min內完成。

4、所有標本和陽性對照必須被當作具有潛在感染性的物質進行處理。

5、打開后的96微孔板應置于可封口的有干燥劑的口袋中貯存于2～8℃，打開后6周內用完。

6、終止液中含0.46mol/L硫酸，避免接觸到皮膚和眼睛。如果終止液接觸到這些部位立即用水沖洗。

7、底物液避光保存，不使用已經變藍的底物液。

8、避免試劑、金屬離子、氧化性物質及微生物污染。

9、因標本中可能存在某些腺病毒，該病毒具有與眼結膜結合的能力，在檢測過程中應避免手與眼的接觸。

10、ELISA板微孔不能反復使用。

本公司專業提供原裝RD試劑盒，RB試劑盒，IBL試劑盒，提供免費待測服務！

 檢測標本：血清或血漿/本產品僅供科研使用

供應商：上海恒遠生物科技有限公司（國內供應商）

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